Informace o předmětu

KBB/IPRP Izolace a purifikace rekombinantního proteinu


garant: RNDr. Petr Nádvorník, Ph.D.
typ: cvičení (3h, výuka v blocích)
kombinace:
typ ukončení: Zápočet, kolokvium
kredity: 3

Sylabus přednášek:

Sylabus cvičení:
Náplní tohoto praktického cvičení je transformace bakterií Escherichia coli plazmidem nesoucím gen pro enzym Taq-DNA-polymerázu, indukce bakterií pro jeho produkci, izolace a purifikace tohoto proteinu. Nakonec bude s tímto izolovaným a vyčištěným proteinem provedena PCR amplifikace, aby se studenti přesvědčili, že získali plně funkční protein se zachovanou biologickou aktivitou, srovnali jeho koncentraci s komerčně dostupnou Taq-DNA-polymerázou a vyjádřili úsporu při laboratorní produkci tohoto enzymu. Studenti si prakticky vyzkoušejí transformaci bakterií plazmidem, indukci exprese proteinu, izolaci proteinu a jednotlivé kroky jeho purifikace jednak vychytáním cílového proteinu s His-tagem pomocí afinitní chromatografie na TALONové kuličky a též alternativním postupem izolace za působení vyšší teploty a lyzozymu. Dále budou během jednotlivých kroků purifikace odebírat vzorky polymerázy v různém stupni čistoty. Na konci cvičení s těmito vzorky provedou orientační elektroforézu v polyakrylamidovém gelu, kdy po obarvení tohoto gelu budou moci sledovat ubývání nežádoucích příměsí mezi jednotlivými kroky purifikace.

Sylabus zkoušky:

Doporučená literatura:

Šmarda, J. a kol. Metody molekulární biologie. Nakladatelství MU Brno, 2005. ISBN 80-210-3841-1.
Sambrook, J., Russell, D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (3rd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001.
Rosypal S. Úvod do molekulární biologie, I., II., III. a IV. díl. Brno, 1997.